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SELLECK

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Selleck Chemicals创立于2006年,总部设在美国德克萨斯州休斯敦,其在亚洲和欧洲设有分部。截至2013年11月,Selleck Chemicals在全世界拥有共50个区域性代理商和合作伙伴。Selleck与超过20,000名客户已建立长期稳定的关系,主要客户包括世界各大制药厂,生物科技公司,医院及各大临床诊断实验室,世界各著名高校、研究所以及政府机构等。为了能为中国的科学家带来更专业、高质量的科研试剂,Selleck Chemicals在上海设立Selleck(中国),全权负责其在华业务的拓展。与此同时,Selleck Chemicals在中国授权了四家代理商,以帮助中国的科学家获得我们高质量的产品和技术服务。2013年伊始,Selleck Chemicals成为辉瑞(Pfizer)授权生产供应商,此项合作是Selleck发展的重要里程碑。从此我们的客户使用辉瑞公司独特和高品质的化合 物库。无论您是购买单个产品还是整个化合物库,这些产品均可广泛的应用于临床前人类疾病研究。作为一个高速成长中的公司,Selleck Chemicals秉持开放的合作态度,欢迎并将逐步建立与其他优秀医药企业的合作伙伴关系。
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BioAssay Systems

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美国博世生物技术有限公司(BioAssay Systems) 是一家位于北加州湾区的高新生物技术公司。博世生物以研发、生产和销售高品质的生物检测制剂为主;公司产品种类齐全,主要用于科学研究和生物医药开发;客户涵盖药物研发公司、生物技术公司、各大专院校、医院、环境和食品卫生部门等。客户使用我们的产品在重要学术刊物发表论文。迄今产品远销北美、南美洲、亚太地区、欧洲、非洲各地,及中国的北京、上海、天津、厦门、成都等大中城市。博世生物产品主要包括:1、血液尿液化学;2、酶活性测定;3、能量代谢;4、氧化应激;5、高通量HTS试剂;6、阴阳离子检测。
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Abbkine

生物化学/抗体/蛋白质/抗原/多肽/ELISA 试剂盒

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 Abbkine 品牌由一群志同道合的科学家和营销专家,在2012年成立于美国加利福尼亚州,随着亚洲市场的迅猛增长,Abbkine将总部搬迁至中国,转移其生产线和相关技术,由中方资本控股,并整合各方面资源,历史性地开辟了中国生产基地,立足中国,服务全球。Abbkine的产品线包括免疫分析试剂、标签及内参抗体、特色二抗、蛋白质纯化产品和其它分子生物学试剂盒,以满足世界各地的大学科研所、医院研究以及生物医学研究机构科学家的研究与分析需求。 
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如何绘制表达谱并验证?

人阅读 发布时间:2019-07-22 09:04

尽管*个microRNA是在1993年发现的,但直到zui近几年,人们才开始了解这种小RNA分子的大作用。miRNA通过与转录本的相互作用,关闭或抑制基因的表达。zui近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达,这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时,miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。

然而,miRNA很小,这就增添了研究的难度。如何绘制灵敏而特异的表达谱?如何上调或下调特定的miRNA?如何验证结果?全靠自己摸索,体会是很深,但时间也花不少。收集了来自*研究院的专家的实际操作经验,这将让你少走弯路。
 
 
Q1:你使用什么方法来确保灵敏而特异的miRNA表达谱?为什么?

Galina Gabriely(哈佛大学)

我们通常利用多重定量PCR来对少量的人miRNA进行小规模图谱分析。这种方法的灵敏度和特异性比芯片更好,因此在待分析miRNA数量不多时是。多重定量PCR图谱分析的准确性可用更加灵敏的单重分析来验证。

Peng Jin(埃默里大学)

我们一般采用miRNA TaqMan分析来确定特定miRNA的表达。我们尝试了多种方法,发现TaqMan的灵敏度和特异性更好。当然,在小RNA的数字表达谱上,我们也使用高通量测序,它与TaqMan分析有着很好的相关性。

Winston Kuo(哈佛大学)

我们已经使用过多种miRNA图谱分析技术,包括Exiqon、Febit、High Throughput Genomics、Invitrogen和Luminex。Exiqon的microRNA芯片平台含有LNA寡核苷酸捕获探针。LNA是核苷衍生物,它提高了双链分子的解链温度。这大大改善了双链分子的热稳定性和特异性。LNA核苷的掺入还能实现捕获探针的Tm均一化。这对芯片的性能非常重要,因为miRNA很短,Tm差异大。Luminex的FlexmiR microRNA panel结合了Exiqon的LNA探针来实现高特异性。HTG则采用了互补的核酸酶保护探针与样品中的miRNA杂交,然后进行S1核酸酶反应来破坏错配的探针,非常灵敏。

Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)

在我们实验室,我们正在采用定制的芯片,主要因为它经济且易用。对于更高的灵敏度,也有好的选择,如Exiqon和Agilent的芯片及Applied Biosystems的TaqMan array。

Silvia Monticelli(瑞士生物医学研究所)

在多年的northern杂交和点杂交后,我们越来越多地使用Applied Biosystems的miRNA TaqMan分析,它非常特异和灵敏,而且数据总是与northern blot很好地关联。

Q2:你如何验证表达结果?

Galina Gabriely(哈佛大学)

我们使用TaqMan microRNA assay的定量RT-PCR,并用其它稳定表达的miRNA来标准化数据。你也可以使用snoRNA来标准化。不管怎样,我们一般使用两个或三个不同分子来标准化,以确保可靠地预计miRNA的量。同时,为了确保结果可重复,我们会重复实验。

Peng Jin(埃默里大学)

通过早期不同分析形式的比较,我们发现miRNA TaqMan分析是非常可靠的。对于高丰度的miRNA,我们也用传统的northern blot来验证表达数据。

Winston Kuo(哈佛大学)

我们利用三种互补的策略验证表达结果:
1. qPCR:我们使用过两种方法,miScript SYBR Green System(Qiagen)和TaqMan miRNA assays(ABI)。我们倾向于前者,因为它含有poly-A加尾方法,回避了内源3’端miRNA序列多样性的问题。这种多样性是TaqMan茎环结构反转录引物策略的问题。从技术的角度,单个oligo dT的反转录反应(Qiagen)在费用、移液操作和可变性方面优于茎环结构的反转录。我们在384孔板上开展qPCR分析,每个处理组有四个样品和三次实验重复(总共12个孔),以获得可靠、重复性好的结果。同时还包括无模板、无引物的对照。


2. Northern blotting:我们使用放射性标记的LNA寡核苷酸作为探针,进行miRNA的northern blot。许多miRNA在功能相关家族中发现,这些家族成员的种子序列为100%同源,只有3’端变化。因此,在使用qPCR或northern时,你必须验证分析只检测目的miRNA,而不是其它成员。我们在玉米(Zea)RNA载体背景中加入合成的成熟miRNA(IDT)来验证。

就northern来说,每个miRNA家族成员的合成miRNA在含有8M尿素的15% PAGE胶上进行。优化杂交温度,让LNA探针只与目的miRNA结合,而不与其它成员结合。一旦利用加标策略建立了适当的northern杂交条件,就能应用于实验样品。

3. 原位杂交:我们也利用Exiqon的DIG标记的miRCURY LNA microRNA检测探针,来确认我们的miRNA表达结果和组织特异性。

Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)

无论使用哪个平台,小心验证所有的芯片结果是很重要的。我们一般使用northern blotting(当我们有较多RNA时),或者实时定量PCR(当RNA比较珍贵时)。我们发现只有操作正确,两种方法都能产生高质量的表达数据。Northern blotting比较便宜,但需要很多RNA,而定量PCR更灵敏,也更贵。
 

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